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Nature Communications volume 13, numero articolo: 3385 (2022) Citare questo articolo

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I cluster estremamente rari di cellule tumorali circolanti (CTC) sono sempre più apprezzati come precursori altamente metastatici e praticamente inesplorati. Le tecnologie sono progettate principalmente per rilevare singole CTC e spesso non riescono a tenere conto della fragilità dei cluster o a sfruttare i marcatori specifici dei cluster per una maggiore sensibilità. Nel frattempo, le poche tecnologie destinate ai cluster CTC mancano di scalabilità. Qui presentiamo il Cluster-Wells, che combina la velocità e la praticità della filtrazione su membrana con lo screening sensibile e deterministico offerto dai chip microfluidici. I >100.000 micropozzetti nei Cluster-Wells arrestano fisicamente i cluster di CTC nel sangue intero non trattato, isolando delicatamente praticamente tutti i cluster a una produttività di >25 mL/h e consentendo il recupero dei cluster vitali dal dispositivo. Utilizzando i Cluster-Wells, abbiamo isolato cluster di CTC che vanno da 2 a oltre 100 cellule da pazienti affetti da cancro alla prostata e alle ovaie e abbiamo analizzato un sottoinsieme utilizzando il sequenziamento dell'RNA. L’isolamento di routine dei cluster di CTC democratizzerà la ricerca sulla loro utilità nella gestione del cancro.

Singole cellule tumorali circolanti (CTC) raccolte dal flusso sanguigno di pazienti affetti da cancro forniscono preziose informazioni sullo stadio della malattia1, consentono prognosi e diagnosi minimamente invasive2,3,4, migliorano la nostra comprensione delle metastasi a livello cellulare5,6 e offrono la possibilità di potenziale per migliorare la gestione clinica del cancro7,8. Oltre a queste singole CTC, gli aggregati di CTC che rimangono attaccati in circolazione sono di grande interesse scientifico e clinico sin dagli anni '50. Sebbene questi cluster di CTC, o microemboli tumorali circolanti, siano estremamente rari (stimati solo nel 2-5% di tutte le CTC), sono sproporzionatamente efficienti nel seminare metastasi. Si stima che la loro propensione metastatica sia 100 volte superiore a quella delle singole CTC9,10,11, in base al loro tasso di apoptosi inferiore e alle ridotte caratteristiche di sopravvivenza prolungata9,12. Inoltre, è stato scoperto che un sottoinsieme di cluster di CTC derivati ​​​​dal paziente includeva cellule immunitarie dell'ospite13,14, evidenziando l'utilità di questi precursori metastatici per far luce sulle interazioni tumore-sistema immunitario e sul loro ruolo nelle metastasi. Ad esempio, è stato dimostrato che i cluster di CTC che trasportano neutrofili hanno un maggiore potenziale metastatico nei pazienti con carcinoma mammario avanzato14, dove le CTC associate ai neutrofili dimostrano livelli di espressione più elevati della proteina marcatore di proliferazione (Ki67) e dei geni associati alla progressione del ciclo cellulare. Studi clinici hanno supportato i risultati di queste indagini biologiche, rilevando che la presenza di cluster di CTC è associata a una sopravvivenza libera da progressione e a una sopravvivenza complessiva del paziente più brevi15. Lo studio approfondito dei cluster CTC, quindi, offre grandi promesse nel migliorare la comprensione e la gestione delle metastasi.

Ad oggi, l'isolamento affidabile ed efficiente dei cluster di CTC vitali è stato limitato perché la sensibilità e la specificità delle tecnologie di isolamento delle CTC sono calibrate principalmente per il rilevamento di singole cellule16,17,18,19. Le tecniche di microfiltrazione, ad esempio, sono ampiamente utilizzate come test CTC grazie al loro funzionamento rapido e semplice16,19,20. Tuttavia, i cluster di CTC sotto pressione fisiologica possono riorganizzarsi come strutture a catena a file singolo e attraversare costrizioni fino a 5 μm11, il che suggerisce che gli aggregati possono probabilmente passare attraverso i pori del filtro, date le pressioni molto più elevate impiegate nella filtrazione. Inoltre, forze di taglio più elevate sperimentate durante la microfiltrazione potrebbero danneggiare i cluster di CTC o dissociarli in singole cellule21, minando un arricchimento efficiente. D'altro canto, i sistemi di arricchimento basati su anticorpi, utilizzati da tempo per l'isolamento di singole CTC17,22,23, possono rilevare solo una sottopopolazione selezionata di cluster di CTC all'interno della popolazione eterogenea di CTC a causa della loro dipendenza da specifici antigeni di membrana13 ,24. Inoltre, il minore rapporto superficie-volume dei cluster CTC ha un impatto negativo sull’efficienza dell’immunocattura delle tecnologie basate su anticorpi25, rendendole particolarmente inefficienti per l’arricchimento dei cluster CTC. Più promettenti a questo riguardo sono i recenti chip microfluidici mirati specificamente ai cluster CTC, che possono raggiungere sensibilità relativamente più elevate. Sfortunatamente, lo fanno a velocità di lavorazione clinicamente impraticabili21,26 o sotto il rischio di danni ai cluster a causa delle velocità di flusso elevate nei canali stretti27, una preoccupazione particolarmente rilevante per i cluster di grandi dimensioni, che sono stati segnalati occasionalmente costituiti da decine di decine di canali. delle cellule tumorali28.

4) shots of each cluster, ensuring none of the clusters were missed and (2) capture multiple different conformations within the field of view, increasing the accuracy of cluster size estimation. We validated (see "Methods": measurement of the device sensitivity) the optimized characterization setup by operating the 2-channel microfluidic interface in a loop without the device attached to confirm there were no cell loss in the system (Supplementary Table 1) and also by ensuring the cluster counts obtained using our setup matched with the direct counts of the captured clusters on the device (Supplementary Fig. 4)./p>500 mL/h, spiked cell clusters dissociated in the device, as evidenced by the mismatch observed between the size distributions of spiked and processed cell populations (Supplementary Fig. 5)./p>2× (87% vs 37%) the efficiency of the Cluster-Chip (Supplementary Fig. 8). Even when compared to the reported release efficiency of a Cluster-Chip operated at 4 °C to reduce non-specific cell adhesion to the microfluidic chip, the Cluster-Wells demonstrated greater efficiency (87% retrieval for the Cluster Wells vs 80% for the Cluster-Chip)./p>150 cells, with the latter found in a sample from an ovarian cancer patient (Fig. 4a, iii). Besides raising questions on the physiological circulation of CTC clusters, the surprisingly large size of the isolated ovarian cancer CTC cluster points to a potential drawback of microfluidic chips, even if they are designed with CTC clusters in mind: a CTC cluster of this size would have likely clogged narrow microfluidic channels or split into smaller pieces if forced through. Some of the isolated CTC clusters were also found to contain leukocytes in both ovarian and prostate cancer samples (Fig. 4a, ii and b, iii), an observation consistent with previous reports on breast cancer CTC clusters14. To confirm physical cohesion between cells in these leukocyte-associated CTC clusters, such clusters were purposely expelled from microwells and then recaptured./p>50 rpm) of CD44. It has been previously reported that CD44 homophilic interactions and subsequent CD44–PAK2 interactions mediate tumor cell aggregation42 and improve stemness, survival, and metastatic progression43,44. Similarly, all CTC clusters expressed high levels of TIMP1, JUN, and FOS, which are known to stimulate cell proliferation, inhibit apoptosis, and regulate angiogenesis45,46. Furthermore, we have performed overrepresentation enrichment analysis for the "TOMLINS_PROSTATE_CANCER_UP" gene set from the MSigDB database at the Broad Institute, which lists the genes that are upregulated in prostate cancer compared to benign tissue47. As observed from the heatmap plot, all CTC clusters as well as prostate cancer cell lines expressed high levels of these genes consistent with their prostate tumor origin. We have also performed a similar analysis for the "CHANDRAN_METASTASIS_TOP50_UP" gene set from the MSigDB database, which includes the genes upregulated in metastatic prostate cancer tumors compared to the primary tissue48. Upregulation of the genes associated with metastasis in all clusters is in agreement with the enhanced metastatic potential of CTC clusters9,10. Among the set, we observed the highest expression levels in HSPD1 and HSP90AA1 genes that are members of heat shock proteins (HSPs), playing important roles in cancer development and invasion, progression, metastasis, and drug resistance in various cancer types49,50. Also, all CTC clusters expressed high levels of G3BP1 which has been correlated with the malignant degree of the tumor51 and observed to be most abundant in castration-resistant prostate cancer (CRPC)52, which agrees with the clinical diagnosis of both Patient-1 and Patient-2 (Supplementary Table 2)./p>150 cells in the samples tested, two observations seemingly at odds with each other and which have potential implications for the circulation of CTC clusters in the body. The frequency of CTC clusters in the peripheral blood of ovarian cancer patients may present valuable opportunities for further study to better understand hematogenous dissemination of ovarian cancer55 as well as opportunities for early detection of disease onset and tumor recurrence—two major problem areas for ovarian cancer, since the disease is asymptomatic early in its progression/recurrence56./p>