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Jul 27, 2023

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Nature Communications volume

Nature Communications volume 13, numero articolo: 4450 (2022) Citare questo articolo

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Le terapie antitumorali spesso mostrano solo effetti a breve termine. I tumori in genere sviluppano resistenza ai farmaci causando ricadute che potrebbero essere affrontate con combinazioni di farmaci. L'identificazione della giusta combinazione è impegnativa e trarrebbe vantaggio da schermi combinatori ad alto contenuto e ad alta produttività direttamente sulle biopsie dei pazienti. Tuttavia, tali screening richiedono una grande quantità di materiale, normalmente non disponibile per i pazienti. Per affrontare queste sfide, presentiamo un flusso di lavoro microfluidico scalabile, chiamato Combi-Seq, per esaminare centinaia di combinazioni di farmaci in goccioline delle dimensioni di un picolitro utilizzando i cambiamenti del trascrittoma come lettura degli effetti dei farmaci. Abbiamo ideato un approccio deterministico combinatorio di codici a barre del DNA per codificare le condizioni di trattamento, consentendo la lettura basata sull'espressione genica degli effetti dei farmaci in modo altamente multiplex. Applichiamo Combi-Seq per esaminare l'effetto di 420 combinazioni di farmaci sul trascrittoma delle cellule K562 utilizzando solo ~ 250 goccioline di singole cellule per condizione, per prevedere con successo coppie di farmaci sinergici e antagonisti, nonché le loro attività di percorso.

Nonostante i grandi progressi compiuti negli ultimi decenni, il cancro rimane una delle principali cause di morte. La nostra maggiore comprensione molecolare delle basi molecolari del cancro ha portato allo sviluppo di terapie mirate. Queste terapie hanno finora fornito un’efficacia limitata e solo in un piccolo sottogruppo di pazienti1, nonostante i maggiori sforzi per caratterizzare genomicamente i pazienti per trovare biomarcatori di risposta.

Un approccio che promette di migliorare questa situazione è quello di integrare la profilazione genomica di grandi dimensioni in condizioni basali con misurazioni dopo aver perturbato le cellule tumorali con farmaci2. Sebbene sia possibile utilizzare molti approcci per eseguire lo screening farmacologico, spesso hanno una produttività ridotta3, costi e tempi lunghi4 e/o richiedono grandi quantità di cellule5, che insieme limitano fortemente il numero di potenziali farmaci che possono essere sottoposti a screening per biopsia tumorale. Questa limitazione diventa più pronunciata quando si considerano le combinazioni di farmaci a causa dell’enorme numero di potenziali combinazioni, che aumenta esponenzialmente con il numero di farmaci testati.

A causa delle limitate capacità di screening, sono stati sviluppati approcci computazionali per modellare le interazioni farmaco-farmaco6. Mentre i modelli sull’efficacia dei farmaci sono migliorati negli ultimi anni grazie all’aumento delle risorse di dati disponibili, le previsioni sulle risposte ai farmaci rimangono impegnative e limitate a sistemi ben caratterizzati come le linee cellulari, limitando così la loro traducibilità in ambito clinico. Tra i diversi tipi di dati, gli stati di espressione genica delle cellule hanno dimostrato di essere altamente predittivi della risposta ai farmaci7. Inoltre, gli archivi di dati sui cambiamenti trascrizionali indotti dai farmaci, come LINCS8, si sono rivelati una risorsa preziosa. Sebbene siano già disponibili piattaforme di screening delle perturbazioni in piastre per la trascrittomica di massa9,10 e di singole cellule11,12, di solito richiedono un gran numero di cellule per condizione testata e non sono state utilizzate per lo screening di combinazioni di farmaci. Pertanto, l'integrazione delle letture trascrittomiche in una piattaforma miniaturizzata di screening combinatorio dei farmaci con il potenziale per schermare le biopsie tumorali consentirà previsioni più rilevanti e aumenterà la nostra comprensione della modalità di azione delle interazioni farmaco-farmaco sinergiche e antagoniste.

La microfluidica basata su goccioline, che utilizza goccioline di dimensioni da picolitri a nanolitri come recipienti di reazione per eseguire schermi cellulari, fornisce un approccio promettente per raggiungere questo obiettivo. A causa della miniaturizzazione di diversi ordini di grandezza rispetto agli schermi convenzionali basati su piastre, il numero di farmaci o combinazioni di farmaci può essere notevolmente aumentato lavorando con un basso numero di cellule di input13. In precedenza abbiamo dimostrato il primo passo in questa direzione integrando le valvole Braille in un sistema microfluidico a goccioline per generare combinazioni di farmaci nei cosiddetti tappi (~ 500 nl di goccioline grandi) immagazzinate sequenzialmente nei tubi14. Sono stati utilizzati plug per esaminare direttamente 56 opzioni di trattamento combinatorio su biopsie di tumore pancreatico per trovare le coppie di farmaci più potenti utilizzando una lettura dell'apoptosi fenotipica. Mentre il nostro approccio precedente ha fornito la prima prova di concetto nello screening diretto del materiale dei pazienti, i volumi ancora relativamente grandi di 500 nl limitavano il numero di coppie di farmaci testati. Inoltre, un test di apoptosi fornisce solo una singola lettura dell’endpoint con informazioni limitate sulla modalità di azione delle coppie di farmaci, il che potrebbe migliorare significativamente la nostra comprensione e la prevedibilità delle combinazioni di farmaci per affrontare i meccanismi di resistenza.